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【昊文章】鄭樹森院士團隊MC發文ALKBH5介導m6A影響肝癌進展

發稿時間:2020-09-03來源:天昊生物

近日,浙江大學醫學院附屬第一醫院肝膽胰外科鄭樹森院士團隊在Molecular Cancer雜志(IF=15.302)發表最新研究成果:去甲基化酶ALKBH5通過m6A修飾表觀上抑制下游靶點LYPD1從而限制了肝細胞癌的惡性。這一發現突出了m6A去甲基化酶的重要價值,豐富了對m6A表觀修飾在癌癥研究中的理解,進一步為開發有效的預測因子和HCC治療策略提供了新的見解。其中,陳云浩博士作為論文的第一作者,鄭樹森院士和吳健教授作為論文的共同通訊作者(https://doi.org/10.1186/s12943-020-01239-w)。天昊生物有幸參與了論文的甲基化RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq)和數據分析工作。




m6A修飾作為一種新興的表觀遺傳調控,廣泛參與肝細胞癌(HCC)的腫瘤發生過程,為研究該疾病的分子發病機制提供了新的視角。多個m6A甲基化酶或去甲基化酶在HCC中已經有相關報道參與腫瘤進展,如METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、FTO。然而m6A去甲基化酶之一AlkB同源物5 (ALKBH5)HCC中的作用尚未得到充分證實。因此,課題組在這項研究力圖闡明ALKBH5HCC中的生物學特性和潛在機制?,F將主要研究結果呈現給大家:





一、ALKBH5的表達下調與HCC患者不良預后相關

為了研究ALKBH5HCC中的表達,作者首先分析了ALKBH5HCC及相應癌旁組織中的mRNA和蛋白水平,發現ALKBH5HCC中顯著下調(1a-c)。隨后,來自一個獨立HCC隊列的免疫組化證實了這些結果(圖1d, e)。此外,較低ALKBH5表達的HCC患者其總生存期(OS)和無復發生存期(RFS)更短(圖1f)。另外,ALKBH5的缺失可以作為HCC患者的獨立預后因素(HR = 2.24, P = 0.007)(圖1g)。這些結果提示ALKBH5的失調可能參與了HCC的進展。




二、ALKBH5在體外和體內抑制HCC增殖

為了評估ALKBH5HCC中的生物學功能,首先在細胞系中利用CCK-8和菌落形成實驗發現敲低ALKBH5可增強HCC細胞的增殖能力,而上調ALKBH5則表現出相反的效果(2a)。同樣,體外EdU檢測也顯示ALKBH5可以抑制細胞生長(圖2b-e)。其次,在小鼠模型中發現當ALKBH5沉默時,與對照組相比,移植瘤體積和重量均增加(圖2f)。相反,過表達ALKBH5會限制腫瘤生長,顯著降低腫瘤體積和重量(圖2g)。這些結果表明ALKBH5在體內外均能抑制HCC腫瘤生長。





三、ALKBH5抑制HCC細胞的遷移/侵襲能力,并抑制體內轉移

研究人員利用transwell實驗發現抑制ALKBH5促進了HCC細胞的遷移和侵襲能力,而過表達ALKBH5則影響了這些表型(圖3a)。傷口愈合實驗也顯示,ALKBH5有減弱HCC細胞遷移的趨勢(圖3b)。有趣的是,當ALKBH5沉默時,研究人員總能在顯微鏡下觀察到細胞形態的改變。為了驗證這種現象是否由細胞骨架重塑引起,隨后進行了鬼筆環肽(phalloidin)染色。正如預期的一樣,通過微管和微絲的重排,ALKBH5的敲低導致細胞骨架更加松散和分散(圖3c, d),這表明一種更加活躍的遷移形式。為了闡明ALKBH5在體內對HCC轉移的影響,將ALKBH5過表達和陰性對照HCCLM3-luc細胞經尾靜脈注射植入BALB/c小鼠體內,并進行生物發光成像。結果發現激活ALKBH5可以降低HCC細胞的轉移潛能,具有更低的熒光素酶活性及更少的肺轉移灶(圖3e, f), HE染色結果也證實了這一點(3g)。相反,沉默ALKBH5則促進了HCC的轉移。因此,ALKBH5在體外抑制了HCC細胞的遷移/侵襲能力,在體內抑制了轉移能力。




四、MeRIP-seq結合RNA-seq結果顯示LYPD1是ALKBH5的靶點

作者首先應用dot blot檢測了ALKBH5m6A修飾的調節作用。ALKBH5的缺失導致Huh7MHCC97H細胞中m6A水平明顯升高,而過表達ALKBH5則產生相反的結果(4a)。為了發現觀察到的依賴ALKBH5表型的確切機制,作者利用穩定的ALKBH5過表達和載體轉染的HCCLM3細胞(每組兩個生物學重復),采用MeRIP-seq和RNA-seq相結合的方法(天昊生物參與部分實驗和分析工作)。MeRIP-seq顯示,當ALKBH5上調時,有1538個差異的m6A peaks豐度降低(1344個相應的轉錄本)。同時,RNA-seq發現了481個在ALKBH5過表達時下調的轉錄本。作者更重視甲基化模式和表達水平受ALKBH5調控的癌基因。因此只選擇那些在ALKBH5過表達時同時具有低的m6A peaks和表達降低的轉錄本進行后續研究(4b)。為了進一步縮小候選基因的范圍,集中在重疊的前10個基因,即COCH、LYPD1、ADAMTS14、ABCA4、TP53I11、COLCA2、TMED7、CYP4F3、IL17RBVCAN。在ALKBH5沉默或過表達的細胞中通過qPCR進行初步驗證(圖4c)。有趣的是,在所有三種肝癌細胞中,只有LYPD1始終被ALKBH5負向調控(圖4d-g),western blot結果進一步證實了這一點(圖4h)。綜上所述,LYPD1可能是ALKBH5的直接下游靶點。





五、ALKBH5依賴于IGF2BP1介導m6A修飾破壞了LYPD1的穩定性

MeRIP-seq分析顯示,隨著ALKBH5的過表達,LYPD13’UTRm6A peak顯著縮小(圖5a)。為了證實這一結果,首先在Huh7HCCLM3細胞中使用anti-ALKBH5抗體進行RIP實驗。結果觀察到,ALKBH5可以富集LYPD1 mRNA(圖5b),這意味著LYPD1可能在與ALKBH5相互作用后在RNA水平上受到調控。然后,利用針對潛在m6A位點的設計特異性引物進行MeRIP-qPCR檢測,結果顯示,敲低ALKBH5可促進LYPD1 3’UTR區修飾,而激活ALKBH5可導致該位點m6A水平下降(圖5c)。為了進一步證明m6A在調控LYPD1中的重要作用,研究人員設計了一個熒光素酶報告基因,插入一個野生型(WT) LYPD1 3’UTR序列或突變體(Mut),其對應的m6A位點發生了突變(圖5d)。與預期的一樣,當ALKBH5沉默時,轉染LYPD1-WT質粒的細胞熒光素酶活性呈上升趨勢,而突變組的熒光素酶活性似乎未受影響。類似的結果也可以在ALKBH5過表達的細胞中得到驗證(圖5e)。此外,研究發現ALKBH5缺乏導致LYPD1 mRNA降解速度減慢,而ALKBH5過表達則破壞了LYPD1的穩定性(圖5f)。

已經明確了閱讀器(readers)m6A修飾的轉錄本的直接影響至關重要,作者進一步研究了參與上述過程的潛在效應物。結果發現YTHDF1/2IGF2BP2/3的干預對LYPD1的表達幾乎沒有影響。然而,當IGF2BP1受損時,LYPD1明顯受到抑制(5g),這與IGF2BP1促進其靶點轉錄的認識是一致的。RIP實驗證實了IGF2BP1蛋白與LYPD1 mRNA的相互作用(圖5h)。此外,IGF2BP1敲低抑制了ALKBH5缺失引起的LYPD1積累(圖5i)。綜上所述,LYPD1ALKBH5介導的m6A修飾調控,并被IGF2BP1識別從而增強了其穩定性。




六、LYPD1被確認為HCC的致癌驅動基因

為了闡明LYPD1HCC中的作用,研究人員建立了LYPD1敲低的Huh7MHCC97H細胞系(圖6a, b)。CCK-8和菌落形成試驗表明,沉默LYPD1抑制細胞生長和生存能力(6a, b),這一結果與EdU結果一致(圖6c, d)。此外,LYPD1缺失導致HCC細胞遷移和入侵能力的抑制(圖6e, f)。為了評估LYPD1在體內的作用,慢病毒攜帶shRNA靶向LYPD1轉染到Huh7MHCC97H細胞,隨后在裸鼠身上進行了皮下植入實驗。正如預期的那樣,LYPD1基因敲低顯著影響了移植瘤的生長(圖6g, h)。

此外,作者進行了生物信息學分析以探討LYPD1的臨床相關性。TCGAHCC隊列和GEO數據集的其他三個隊列的分析表明,與正常組織相比,腫瘤組織中LYPD1表達上調(圖6i)此外,Kaplan-Meier分析提示在HCCLYPD1高表達與較差的OSDFS相關(圖6j)。綜上所述,LYPD1HCC發展過程中被激活,并促進了HCC的腫瘤發生。





七、ALKBH5的抑制作用被LYPD1的缺失所逆轉

為了證實觀察到的表型是由ALKBH5-LYPD1信號軸的失調介導的,研究人員進行了多次功能拯救實驗。CCK-8和菌落分析顯示,ALKBH5的表達降低導致兩種HCC細胞的增殖能力增強,而這種能力可以通過沉默LYPD1逆轉(7a-d)。LYPD1的敲低也顯著地消除了ALKBH5缺失所導致的遷移能力增加(圖7e-g)。此外,傷口愈合實驗表明,抑制ALKBH5不能促進LYPD1沉默的Huh7MHCC97H細胞的遷移(圖7h)。綜上所述,LYPD1功能障礙可能與ALKBH5介導的HCC細胞增殖或遷移特征有關。





八、ALKBH5/LYPD1軸在HCC中的臨床意義

為了進一步探討HCC組織中ALKBH5LYPD1表達的相關性,科研人員在第二個隊列的對這兩個蛋白進行了IHC染色。正如所料,大約有62.2%的標本的表達較低的ALKBH5但是呈現出強LYPD1染色,而近66.7%ALKBH5高表達樣本表現出較弱的LYPD1染色(8a, b)。此外,兩個獨立的GEO數據的分析顯示,ALKBH5LYPD1RNA水平上呈現負相關(圖8c)。綜上所述,在HCC樣本中,ALKBH5LYPD1的表達呈負相關。





天昊生物具有多年基因組、轉錄組和表觀組等多組學檢測與分析的經驗,m6A RNA甲基化作為表觀領域的一大熱點,天昊生物自主設計了m6A調控因子(writers/erasers/readers)差異表達分析檢測panel,還可以提供m6A修飾整體水平定量檢測,并結合MeRIP-seq和RNA-seq挖掘受m6A調控因子影響的下游靶點,同時可對相關的靶點進行MeRIP-qPCR驗證。生信團隊亦可提供個性化的m6A數據庫挖掘與生信分析內容。


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