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天昊16S擴增子絕對定量測序項目新文:金針菇β-型糖苷多糖對結腸炎小鼠的抗炎及腸道菌群調節作用

發稿時間:2020-09-16來源:天昊生物




本研究以金針菇多糖(FVP)為研究對象,研究其對葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結腸炎(UC)模型小鼠的改善作用。用16S擴增子絕對定量測序技術測定小鼠糞便中腸道微生物的絕對豐度和相對豐度。結果表明,FVP治療可減輕UC癥狀,上調或下調結腸組織中相關基因表達水平,并可增強UC小鼠的代謝和生物合成能力。采用相關性分析發現11種腸道微生物包括乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌與UC癥狀相關。這些結果表明,FVP可通過調節特定腸道微生物而減輕小鼠UC癥狀,提高了對FVP作為益生元的功能活性的認識。




  潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩?。?/span>CD)是炎癥性腸?。?/span>IBD)的兩種形式,具有相似的觸發因素,兩者都被歸為慢性炎癥反應,由腸功能不全引起。兩者的區別在于,克羅恩病發生在胃腸道的任何部位,尤其是回腸末端,而UC主要發生在結腸。UC是一種與宿主遺傳、免疫功能紊亂和環境變化有關的間歇性炎癥反應。葡聚糖硫酸鈉(DSS)能破壞腸黏膜屏障的完整性,激活巨噬細胞分泌炎癥因子,最終誘發UC。DSS誘導的UC小鼠是一種典型的模擬人類腸道炎癥性疾病癥狀的模型,包括黏膜蛋白損傷、腸潰瘍、腹瀉、結腸縮短和便血,用于研究不同生物活性成分對腸道健康的影響。

  生物大分子存在于中藥、植物和食用菌中,具有腸道微生物調節等多種生理功能。生物大分子物質與腸道微生物的相互作用,直接導致腸道微生物群落結構的改變,進而影響相關功能酶和蛋白質的表達,這種生理變化與代謝性疾病和炎癥性疾病密切相關。根據報道,代謝性疾病的發生或發展與腸道微生物及其代謝產物的生理活動密切相關,如肥胖和2型糖尿病。更重要的是,腸道微生物與腸道炎癥和癌癥有關,如UC和結腸癌。一項研究表明,枸杞花色苷可通過調節腸道相關蛋白的表達,改變腸道菌群結構,改善DSS誘導的UC小鼠癥狀。黃芪多糖能改善DSS誘導的UC小鼠結腸組織學評分,增加體重和結腸長度,降低NF-κВ DNA磷酸化活性,是治療IBD的天然途徑。石斛多糖具有減輕潰瘍性結腸炎(UC)小鼠結腸組織病理損傷和重建炎性細胞因子平衡的作用。

  金針菇是我國傳統食用菌,具有栽培歷史悠久、工業化生產率高等特點,在我國消費廣泛。以往的研究為金針菇多糖具有調節腸道微生物群的能力提供了佐證,同時,這種不含淀粉的生物活性多糖,通過調節促炎細胞因子的表達,也顯示出一定的免疫調節活性。本實驗室的前期研究表明,金針菇多糖(FVP)能調節腸道菌群,增加血清免疫球蛋白和細胞因子,提示FVP在腸道內的發酵過程可能代表了一種免疫調節能力,總之,FVP具有了調節腸道微生物群和改變免疫反應的能力。但從以往的研究來看,只是證明了FVP對腸道菌群和宿主免疫應答的調節作用,沒有證據表明健康小鼠腸道微生物發生了有益的變化。由于免疫應答與炎癥反應的相關性,有必要研究FVP對腸道炎癥的影響。然而,關于FVP對腸道炎癥的影響的信息很少。因此,闡明FVP與潰瘍性結腸炎(UC)腸道微生物介導的抗炎作用的關系至關重要。

  作為填補我們知識空白的一步,本研究評估了FVPUC小鼠的抗炎作用,結腸組織學改變,促炎細胞因子含量,相對mRNA表達,與炎癥相關的特定腸道微生物種類都被考慮在內。我們假設這種具有β-型糖苷鍵和呋喃糖環的非淀粉多糖可能通過調節腸道微生物群來改變宿主的代謝功能,從而達到抗炎的目的。



FVP

從新鮮金針菇中獲得FVP,FVP81.01%的多糖、7.07%的單糖、1.80%的總酚組成,由甘露糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖連接而成。此外,這種具有β-型糖苷鍵和呋喃糖環的非淀粉多糖(特征吸收率為888.20cm?11037.08cm?1),分別由7473.14 KDa48.09%)和15.077 KDa51.91%)組成。

動物喂養試驗:

4周齡C57BL/6J雄性小鼠(SPF級,20±2g,n=48)購自南京醫科大學,實驗程序在南京農業大學動物中心進行。每只小鼠適應新的25±2°C的生活環境和12/12h的光暗循環7天。所有小鼠均飼喂半純和日糧,飼料成分見表S1。7天后,將小鼠隨機分為4組(SD、SD-FVP、DSS、DSS-FVP):SD組和SD-FVP組在實驗期間給予純水。在DSS組和DSS-FVP組,在第7-11、18-22、29-33、41-44天用1.5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)鹽代替純水。SD-FVPDSS-FVP組在實驗期間每天灌胃給予FVP400mg/kg體重)。在SD、DSS組,小鼠灌胃給予蒸餾水作為對照(圖1A)。每天灌胃給藥后,每只小鼠稱重,以調整第二天灌胃喂養(0.1mL/10g體重)的給藥量。所有的老鼠都是在免費獲得食物和水的情況下飼養的,每周記錄飼料消耗量。疾病活動指數(DAI)評分由體重減輕程度、大便稠度和便血情況決定。實驗結束時,所有小鼠在二氧化碳吸收麻醉后頸椎脫位處死,測量結腸長度,取血清及各臟器(腦、肝、腎、盲腸、結腸),于-80℃保存至檢測。所有動物程序均按照NIH2011年)《實驗室動物護理和使用指南》中的指南進行,所有處理均得到南京農業大學實驗動物中心動物倫理委員會批準,批準文號:SYXK (SU) 2017-0007。

結腸組織的組織學分析:

切除的結腸立即用4%中性福爾馬林固定。組織病理學分析:取標本用乙醇脫水,石蠟包埋切片,二甲苯脫蠟10min,蘇木精伊紅染色觀察。所有組織切片均采用盲法評估。切片根據炎癥浸潤程度(0-5)、隱窩損傷程度(0-4)、潰瘍程度(0-3)和水腫有無(01)進行評分。

細胞因子測定:

采用ELISA試劑盒測定血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1MCP-1)和巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的含量。

盲腸內容物和糞便中SCFAs濃度的測定:

采用氣相色譜分析(GC)測定小鼠盲腸內容物和糞便中SCFAs的濃度,包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸。簡而言之,采集的樣品用H2 SO 4和二乙基進行預處理。使用Agilent 7890A氣相色譜儀進行氣相色譜分析。具體而言,在0.025-0.8mol/L范圍內繪制乙酸的標準曲線,在0.00125-0.4mol/L范圍內添加4-甲基戊酸作為內標,繪制丙酸、異丁酸、正丁酸、戊酸和正戊酸的標準曲線。每個樣品分為三份。

RNA提取及相關基因表達:

Trizol提取小鼠結腸總RNA。使用SMA2000超微量紫外分光光度計進行定量。逆轉錄成cDNA,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為管家基因,用2-ΔΔCt計算基因相對表達水平。

糞便DNA提取及高通量測序:

使用E.Z.N.A.? Bacterial DNA Kit提取小鼠糞便細菌總DNA,DNA樣本送至上海天昊生物科技有限公司進行16S擴增子絕對定量測序(V3-V4)。




FVP可減輕UC的嚴重程度

體重、攝食量、耗水量、疾病活動指數評分、結腸長度和臟器相對重量的變化如圖1所示。SD組和SD-FVP組的體重(圖1B)呈上升趨勢,而DSS組和DSS-FVP組在最后兩個周期(29-33天、41-44天)后體重呈下降趨勢,且DSS組較其它組有顯著下降趨勢(P0.05)。同時,疾病活動指數(DAI)(圖1E)顯示,在第一個周期中,DSS飲用水處理前(0-6天),小鼠的糞便出現形成,沒有腹瀉和便血;在DSS飲用水處理后(7-11天),DSS組的糞便開始軟化,盡管DSS-FVP組的DAI評分高于對照組SD,但低于DSS組。在停止DSS處理后的恢復期(12-17天),DSS組和DSS-FVP組小鼠糞便恢復到健康水平。第22天,DSS組小鼠再次給予DSS處理后,出現輕度便血。第33天,隨著攝食量的減少,DSS組小鼠出現體重減輕,并伴有嚴重腹瀉和便血癥狀。第44天,DSS組小鼠出現腹瀉、便血和攝食量減少,但經FVP給藥后,DSS-FVPUC癥狀明顯減輕,與DSS組比較差異有顯著性(P0.05)。對DSS組和DSS-FVP組小鼠在DSS處理期間的耗水量進行計數,結果顯示無顯著性差異(P0.05)(圖1D)。四組小鼠結腸長度如圖1 F所示,DSS組結腸長度較SDSD-FVP組短(P0.05),但經FVP給藥后,UC引起的結腸縮短癥狀有所減輕(與SDSD-FVP組相比,P0.05)。


FVP減輕組織學改變

小鼠結腸組織的組織學變化如圖2所示。SD組和SD-FVP組生理形態正常,無炎癥反應和上皮細胞損傷。DSS處理后的小鼠結腸杯狀細胞和淺表上皮細胞均消失,單核白細胞浸潤。經FVP治療后,DSS-FVP組病理損傷明顯減輕,大部分杯狀細胞保持正常生理形態,炎癥反應明顯減輕,具體反映在組織學評分中(圖2 I)。


FVP可降低結腸組織和血清中的細胞因子

結腸組織和血清中促炎細胞因子(包括TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、MCP-1MIP-1α)如圖3所示。與SD組相比,DSS組大鼠結腸組織中促炎細胞因子顯著升高(P0.05),FVP治療后,DSS-FVPTNF-α、IL-6、MCP-1MIP-1α水平低于DSS組(P0.05),與SD、SD-FVP組相似。DSS組和DSS-FVPIFN-γ和IL-1β表達水平無顯著性差異。除細胞因子TNF-α外,血清中也有類似的變化趨勢。提示FVP可降低UC致炎性細胞因子的升高。


FVP調節結腸組織中相關mRNA的表達

FVP對結腸促炎細胞因子和緊密連接蛋白mRNA表達水平的影響如圖4所示。與DSS組相比,DSS-FVP可抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、MCP-1、MIP-1α和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的相對mRNA表達。此外,FVP處理后,caludin-1、ZO-1mRNA相對表達增加(P<0.05)??偟膩碚f,FVP可以調節促炎細胞因子和緊密連接蛋白的mRNA表達,減少UC引起的mRNA表達的變化。


FVP改變了盲腸內容物中SCFAs的濃度

盲腸內容物中乙酸,丙酸,異丁酸,正丁酸,異戊酸,正戊酸和總酸的濃度如圖5A所示。DSS組的總酸濃度較低(P0.05)。經FVP處理后,DSS-FVP組總酸、乙酸、丙酸和正丁酸濃度均升高(P0.05)。在糞便樣本中也有類似的趨勢(圖5B)。說明FVP能增加盲腸內容物和糞便中SCFA的含量。


FVP和DSS改變小鼠腸道微生物多樣性

小鼠腸道微生物多樣性分析見圖6。這4組之間的香農和辛普森指數如圖6AB所示,SD組相比,DSS組的Shannon指數和Simpson指數均較低(P0.05),說明UC引起的微生物群落多樣性較低,但經FVP處理后,DSS-FVP組微生物群落多樣性有所提高,正如我們預期的那樣,FVP可以促進UC小鼠體內微生物群落的多樣性。PCAPCoA如圖6CD所示,DSS組在X軸上與SD組和SD-FVP組完全分離(PCA24.786%,PCoA27.55%),經FVP處理后,DSS-FVP組與SD組在X軸(PCAPCoA)的距離均較DSS組近,結果表明,經FVP處理后,DSS引起的腸道菌群變化得到緩解。樣本聚類樹如圖6E所示,顯示DSSDSS-FVP組、SDSD-FVP組的腸道菌群組成相似,而DSS-FVP組比DSS組更接近SD-FVPSD組。維恩圖如圖6F所示,四組小鼠共有408種腸道微生物,經DSSFVP處理后,DSS組有10種獨特的腸道微生物,DSS-FVP組有9種獨特的腸道微生物,SD-FVP組有35種獨特的腸道微生物,說明各組之間的相似性和差異性。


FVP和DSS改變了小鼠腸道微生物的豐度

門水平小鼠腸道微生物的變化如圖7所示,每個樣品主要由Bacteroidetes、Firmicutes、Verrucomicrobia、Proteobacteria、Actinobacteria組成。圖7 A1顯示了糞便微生物群落的絕對豐度,顯示了每克糞便樣品中腸道微生物的細胞總數和每個門的腸道微生物細胞數。圖7 A2顯示了每個門的相對豐度,代表了每個門中腸道微生物的比例。DSS處理后Bacteroidetes數量減少(P0.05),FVP灌胃后Bacteroidetes數量增加到接近SD組和SD-FVP組的水平(P0.05)(圖7B)。相反,FirmicutesDSS處理后顯著增加,而在FVP灌胃處理后減少(圖7c)。Verrucomicrobia, Proteobacteria、Actinobacteria的豐度在圖7A1A2中是浮動的。此外,圖7E所示的Firmicutes / Bacteroidetes比率代表了不同處理組之間的差異。


科水平的相對豐度存在差異,包括Porphyromonadaceae, Erysipelotrichaceae, Verrucomicrobiaceae, Lachnospiraceae, Lactobacillaceae, Bacteroidaceae, Ruminococcaceae, Rikenellaceae(圖8)。Porphyromonadaceae的相對豐度在DSS組呈下降趨勢,但經FVP處理后增加。Lachnospiraceae的趨勢與之相反。四組間乳酸菌相對豐度無顯著性差異,但從絕對定量測序結果來看,DSSLactobacillus的絕對豐度實際上有所下降。


9UC相關癥狀、相關基因表達與腸道微生物相關性分析的進一步研究。共選取11種菌種進行相關分析,測序結果表明,這11種菌種的相對豐度變化趨勢相同:即DSS處理與SD組相比,相對豐度發生變化(增加或減少),而DSS-FVP組經FVP處理后得到恢復,指的是差異的減少或消失,說明經FVP灌胃后,UC引起的腸道菌群失調得到緩解或消除。這11種腸道微生物與腸道炎癥癥狀及相關基因表達呈顯著或極顯著相關。


PICRUSt預測發現FVPDSS改變了微生物群落功能

根據腸道菌群的變化,PICRUSt預測了DSSFVP引起的功能變化,如圖10所示。DSS組與SD組比較,15個(9個富集,6個減少)功能模塊發生改變(P<0.05)。經FVP處理后,DSS-FVP8個功能模塊富集,主要引起一些代謝途徑的改變,如次生代謝物的生物合成、轉運和分解代謝;細胞內的轉運、分泌和囊泡轉運;輔酶和脂質的轉運和代謝。與DSS組相比,DSS-FVP組細胞骨架、細胞壁、膜和包膜生物發生相關的功能模塊也較DSS組得到富集(P<0.05)。



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