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新聞中心

Science重磅:腸道細菌可以提高腫瘤免疫治療效果

發稿時間:2020-09-30來源:天昊生物

英文題目: Microbiome-derived inosine modulates response to checkpoint inhibitor immunotherapy

中文題目:微生物源性肌苷調節檢查點抑制劑免疫治療的響應

期刊名:Science

發表時間:2020年8月13日

單位: 加拿大卡爾加里大學卡明醫學院斯奈德慢性病研究所生理學與藥理學系


  有幾種腸道細菌與免疫檢查點阻斷(ICB)療法的增強效果有關,但微生物組增強抗腫瘤免疫的潛在機制尚不清楚。在這里,我們分離出三種細菌,包括Bifidobacterium pseudolongum (假長雙歧桿菌),  Lactobacillus johnsonii(約氏乳桿菌)和Olsenella(齦乳桿菌),它們在四種小鼠癌癥模型中顯著地增強了免疫檢查點抑制劑(例如CTLA-4和PD-1)的功效。我們發現Bifidobacterium pseudolongum通過產生代謝物肌苷(inosine)來增強的免疫治療療效。免疫治療引起的腸道屏障功能下降增加了肌苷的全身系統轉運和抗腫瘤T細胞的活化。肌苷的作用依賴于T細胞表達的腺苷受體A2AR,并需要共刺激(例如CTLA-4抗體和CpG的共刺激)??傊?,我們的研究確定了一種新的微生物代謝物免疫途徑,它被免疫療法激活,可用于開發基于微生物的輔助療法。


  免疫檢查點阻斷(ICB)療法(免疫檢查點是通過調節免疫反應來維持自身耐受并保護周圍組織的免疫抑制性通路,腫瘤細胞利用這一特性逃避免疫細胞的攻擊。目前研究最廣泛的兩個免疫檢查靶點即細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA-4)和PD-1受體。免疫檢查點抑制劑通過抑制免疫檢查點活性,釋放腫瘤微環境中的免疫剎車,重新激活T細胞對腫瘤的免疫應答效應,從而達到抗腫瘤的作用)可以利用免疫系統的治療潛力,對某些腫瘤和某些癌癥患者是一種有效的治療方法。細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4),程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)或其配體(PD-L1)靶向藥已經徹底改變了一些癌癥的治療,包括黑色素瘤、腎細胞癌和非小細胞肺癌。然而,許多其他癌癥顯示出對ICB治療的原發性抗藥性,并且免疫治療應答率仍然很低,甚至ICB治療有效的那些癌癥患者之間也存在差異,因此,迫切需要確定這種免疫治療不應答的根本原因。最近的研究提供了強有力的證據表明腸道微生物群可以影響抗腫瘤免疫,腸道微生物群的組成甚至可以預測ICB治療的療效。一系列開創性的研究表明,ICB療法的療效取決于特定的腸道細菌,使用促進ICB菌治療可能有助于克服ICB治療的原發性耐藥性。盡管發現特定的細菌種類與增強抗腫瘤免疫有關,但這些微生物增強ICB治療的確切分子機制仍然不清楚。在這項研究中,我們利用大腸癌(CRC)的動物模型來識別特定的促進ICB療效的細菌,闡明這些微生物如何提高ICB治療效果的潛在分子機制,并在膀胱癌和黑色素瘤模型中驗證了我們的發現。


  雖然腸道微生物群可以影響大腸癌的進展,并可能改變化療的療效,但臨床上,ICB治療在大多數大腸癌病例中是眾所周知無效的,而且微生物群在無響應中的作用尚未確定。因此,我們研究了ICB療法在小鼠模型中的療效,該模型使用偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導結腸腫瘤(圖1A)。值得注意的是,用CTLA-4抗體或PD-L1抗體治療可導致腫瘤明顯減少和變?。▓D1B和C),并降低腫瘤中上皮細胞干細胞標志物EpCam+Lgr5+的細胞頻率(圖1D)。CTLA-4抗體治療還導致免疫細胞浸潤到腫瘤中(圖1E)。還觀察到腫瘤引流淋巴結中的CD8+T細胞頻率增加(圖S1A),脾臟中IFNγ+CD4+和IFNγ+CD8+T細胞增加(圖S1、B和C)。在此模型中,當使用相同的抗體劑量時,CTLA-4抗體治療的作用要大于PD-L1抗體治療的作用。在這個模型中,CTLA-4和PD-L1抗體治療療效的差異可能取決于劑量-效應關系,先前已針對PD1治療描述了更高的劑量。此外,CTLA-4和PD1/PD-L1抗體治療的效應器功能依賴于不同的機制,其中調節性T細胞和Treg的組成和功能在不同的癌癥類型和腸道腫瘤中都是不同的。 


  接下來,我們使用這個模型系統來篩選與ICB反應相關的潛在有益細菌。雖然ICB治療組和對照組小鼠的糞便細菌組成(β-多樣性)沒有明顯變化(圖S1D),但少數細菌豐度卻有差異(圖S1E)。相比之下,腫瘤部位相關細菌群落的測序揭示了ICB治療組和對照組小鼠在β多樣性有差異(圖S1F),并且在ICB治療組的腫瘤中,一些額外的細菌豐度與對照組相比存在差異(圖1F和圖S1,G和H)。因此,我們對兩組的均質化腫瘤進行厭氧培養,能夠培養和鑒定出21個不同的細菌菌株:7種細菌僅從ICB治療組的腫瘤中培養得到,而4種細菌僅存在于對照組中(圖1G)。值得注意的是,Bifidobacterium pseudolongum(B. pseudolongum)(假長雙歧桿菌)是僅從ICB治療組的腫瘤中培養出來的菌株之一,Bifidobacterium pseudolongum屬于Bifidobacterium(雙歧桿菌屬),經測序鑒定其豐度存在差異(圖1F和圖S1、G和H)。有趣的是, Akkermansia muciniphila(A. muciniphila)最近被證實能增強PD-L1和PD-1抗體治療肺癌和腎癌的療效,它也是僅從ICB治療組的腫瘤中培養出來的七種細菌之一(圖1G)。分離和鑒定與ICB治療響應相關的不同細菌為我們提供了一個機會來確定所涉及的分子機制。


  接下來,我們確定ICB治療大腸癌的療效是否依賴于微生物群。由于微生物群有限的動物體內原位腺癌的發生率嚴重降低,我們轉而采用異位體內結直腸癌模型,將MC38結直腸癌細胞植入無菌(GF)或無特異性病原體(SPF)小鼠的側腹,一旦腫瘤可觸知,隨后進行ICB治療(圖S2A)。與GF小鼠相比,抗CTLA-4治療導致腫瘤更?。▓DS2B),并顯著增加SPF中腫瘤內和脾臟CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖(圖S2,C到F)。與GF小鼠相比,在SPF小鼠CTLA-4抗體治療導致腫瘤更?。▓DS2B),并顯著增加腫瘤內和脾臟CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖(圖S2,C到F)。為了確保ICB療效的喪失不僅僅是GF小鼠不成熟免疫系統的反映,我們還評估了ICB治療在抗生素處理過的SPF小鼠中的效果(圖S2G),發現與GF小鼠相似,廣譜抗生素也降低了荷瘤SPF小鼠的ICB治療效果(圖S2,H至J),這說明某些微生物的存在能夠提高免疫治療的效果。

  為了評估在ICB治療小鼠腫瘤中富集的分離細菌(圖1G)是否能夠提高ICB治療的療效,我們將五種不同的分離細菌轉移到GF小鼠中,然后制造出了只有一種細菌定植的小鼠。將MC38腫瘤細胞異位注射到單菌定植的小鼠或GF小鼠中,在可觸見腫瘤發生后,對所有小鼠進行CTLA-4抗體治療,并評估腫瘤生長和抗腫瘤免疫(圖1H)。在所測試的五種細菌中,與GF小鼠或Colidextribacter和Prevotella單菌定植小鼠相比,B. pseudolongum, Lactobacillus johnsonii (L. johnsonii) (約氏乳桿菌)和Olsenella(齦乳桿菌)單菌定植小鼠顯著提高了CTLA-4抗體治療的效力(圖1I和J,圖S3A和B)。此外,在B. pseudolongum, Lactobacillus johnsonii和Olsenella單菌定植小鼠腫瘤中,CD4+和CD8+T細胞活化顯著增加(圖1K),而腫瘤內CD8+T細胞(圖S3C和D)的增殖略有增加。與Colidextribacter對照菌相比,分離的促進ICB療效的B. pseudolongum也提高了MC38異位腫瘤小鼠模型中PD-L1抗體治療的療效(圖S4),盡管療效程度低于CTLA-4抗體治療(相同劑量)的觀察結果,類似于我們在AOM/DSS模型中的觀察結果。由于B. pseudolongum對ICB治療的促進作用最強,因此被選作進一步的機理研究。值得注意的是,其他雙歧桿菌,如B. breve和B. longum,以前在小鼠黑素瘤模型中已被發現能促進抗腫瘤免疫并增強PD-L1抗體治療的效力。在人類中,B. longum被報道富含PD1抗體的應答者。此外,B. pseudolongum廣泛分布于哺乳動物腸道中,許多不同的菌株表現出基因組多樣性和不同的代謝能力,表明其具有菌株依賴性功能。



  我們發現抗腫瘤免疫依賴于ICB治療,因為在沒有CTLA-4抗體治療的情況下,B. pseudolongum單菌定植小鼠不能減少腫瘤生長(圖S5A到C)或誘導抗腫瘤免疫(圖S5D和E),重要的是,盡管先前的研究表明,一些細菌在腫瘤環境中積聚,在那里它們局部刺激免疫系統并通過有毒代謝物殺死腫瘤細胞,但我們無法在異位腫瘤中檢測到B.pseudolongum(圖S6),因此,盡管事實上最初是從腸道腫瘤中分離出B. pseudolongum,但在我們的模型中增強ICB治療療效并不需要腫瘤內存在B. pseudolongum,這表明可溶性因子可能參與其中。

  盡管在沒有ICB治療的情況下B. pseudolongum不能誘導抗腫瘤免疫(圖S5),但B. pseudolongum在小腸固有層CD4 + T中誘導Th1主轉錄調節因子T-bet的表達顯著增加。在GF小鼠或Colidextribacter對照菌定植小鼠中未觀察到這個現象(圖2A和B),這說明B. pseudolongum即使在沒有ICB治療的情況下也具有一些免疫調節能力,但是在沒有ICB治療的情況下,這種影響僅限于腸道相關淋巴組織(GALT),在脾臟中沒有觀察到(圖2C)。在沒有ICB治療的情況下B. pseudolongum雖然可以誘導Th1主轉錄調節因子T-bet的表達,但是沒有增加Th1細胞效應器功能的激活,因為IFN-γ+T-bet+細胞在任何被評估的組織中與對照組沒有區別(圖2B和C,以及圖S7A)。綜上,在沒有腫瘤和ICB治療的情況下,雖然B. pseudolongum促進腸道相關淋巴組織(GALT)的Th1轉錄分化,但是沒有增加腸道和引流淋巴結的效應功能。



  由于在沒有腫瘤和ICB治療的情況下B. pseudolongum單菌定植只誘導局部粘膜Th1分化,我們接下來想知道B. pseudolongum和CTLA-4抗體治療在沒有腫瘤的情況下是否會導致全身系統性的Th1活化。事實上,與GF小鼠或Colidextribacter對照菌定植小鼠相比,B. pseudolongum單菌定植聯合ICB治療可顯著增強脾臟Th1細胞活化和效應器功能,IFN-γ的產生可證明這一點(圖2D和E以及圖S7H和I)。綜上,我們的結論是B. pseudolongum誘導Th1分化,并與CTLA-4抗體治療一起激活Th1效應T細胞。

  我們對B. pseudolongum誘導Th1轉錄分化的能力和ICB治療后Th1效應器功能激活的能力感興趣。胃腸道炎癥是CTLA-4抗體治療常見的免疫相關不良反應,我們推斷這可能是由于腸道屏障完整性的降低,事實上,與對照組相比,用CTLA-4抗體治療的單菌定植動物表現出全身血清抗體反應增強,特別是Th1相關的IgG2b,并且小腸經皮電阻降低(圖S8 A和B)。盡管如此, CTLA-4抗體治療并沒有引起明顯的局部或全身炎癥(圖S8、C和D),在這方面,有趣的是,一些雙歧桿菌已經被報道為CTLA-4抗體誘導的小腸結腸炎提供保護,而不影響腫瘤生長。由于CTLA-4抗體治療對缺乏B細胞和抗體的B. pseudolongum單菌定植小鼠也有效,因此ICB治療后誘導系統性細菌抗體對ICB的促進作用并不是必須的(圖S9)。因此,由于細菌不在異位腫瘤中積聚(圖S6),CTLA-4抗體治療降低了腸道屏障的完整性(圖S8),并且B. pseudolongum的ICB治療促進作用不需要B細胞和共生抗體(圖S9),我們假設代謝物的全身系統性易位增加可能是導致B. pseudolongum在ICB治療期間的能在全身起作用的原因。為解決這一問題,從經過CTLA-4抗體治療的攜帶腫瘤的GF小鼠、B. pseudolongum或Colidextribacter單菌定植小鼠中收集血清,然后與CTLA-4抗體一起轉移到GF-MC38荷瘤小鼠中(圖2F)。值得注意的是,來自CTLA-4抗體治療的B. pseudolongum單菌定植小鼠的血清,而不是來自CTLA-4抗體治療的GF或Colidextribacter單菌定植小鼠的血清,足以減少腫瘤生長,并在GF小鼠的腫瘤和脾臟中激發強的抗腫瘤免疫(圖2,G至I和圖S10)??偠灾?,這些數據表明源自B. pseudolongum或由B. pseudolongum誘導的可溶性因子對ICB治療療效起到了促進作用。

  血清樣本的非靶向代謝組學顯示,與GF小鼠或Colidextribacter對照菌定植小鼠相比,B. pseudolongum單菌定植小鼠血清中的幾種代謝物水平增加(圖2J和圖S11A和B)。值得注意的是,嘌呤代謝物肌苷是唯一的代謝物,與GF小鼠或Colidextribacter對照菌定植小鼠相比,B. pseudolongum單菌定植小鼠血清中肌苷inosine含量明顯更高(8至9倍)(圖2K)。值得注意的是,黃嘌呤和次黃嘌呤(肌苷的降解產物)在B. pseudolongum單菌定植小鼠血清中也升高(表S1)。對細菌培養上清液的分析表明,B. pseudolongum h和A. muciniphila產生的肌苷明顯高于Colidextribacter。在相同的培養條件下(圖S11C),揭示肌苷是由B. pseudolongum h和A. muciniphila產生的細菌代謝物。相反,雖然L. johnsonii不產生肌苷,但與Colidextribacter相比,它確實產生了大量的次黃嘌呤(圖S11D),次黃嘌呤是一種與肌苷結合到同一受體上的配體。

  為了測定肌苷在體內的生理水平,我們測定了B. pseudolongum單菌定植小鼠十二指腸、空腸和盲腸中的肌苷含量。肌苷在十二指腸最高,沿胃腸道逐漸降低(十二指腸66.13±14.23μM>空腸29.26±9.38μM>盲腸0.5±0.05μM;圖S11F)。我們還定量了CTLA-4和PD-L1抗體治療的B. pseudolongum單菌定植小鼠清中肌苷的濃度(anti-CTLA-4:26.16±3.32μM,anti-PD-L1:37.5±10.2μM)和Colidextribacter單菌定植小鼠血清中肌苷的濃度(anti-CTLA-4:3.26±1.01μM,anti-PD-L1:4.8±1.3μM)(圖S11F),以及CTLA-4抗體治療前(4.08 ± 1.12 μM)和治療后SPF小鼠血清中肌苷的濃度(11.65±2.09μM),抗生素處理的SPF小鼠血清中肌苷的濃度(2.03±0.86μM;圖S11G)。這些數據表明,細菌在上消化道產生肌苷很可能是B. pseudolongum單菌定植小鼠全身肌苷水平升高的主要來源。

  為了測定肌苷在體內的生理水平,我們測定了B. pseudolongum單菌定植小鼠十二指腸、空腸和盲腸中的肌苷含量。肌苷在十二指腸最高,沿胃腸道逐漸降低(十二指腸66.13±14.23μM>空腸29.26±9.38μM>盲腸0.5±0.05μM;圖S11F)。我們還定量了CTLA-4和PD-L1抗體治療的B. pseudolongum單菌定植小鼠清中肌苷的濃度(anti-CTLA-4:26.16±3.32μM,anti-PD-L1:37.5±10.2μM)和Colidextribacter單菌定植小鼠血清中肌苷的濃度(anti-CTLA-4:3.26±1.01μM,anti-PD-L1:4.8±1.3μM)(圖S11F),以及CTLA-4抗體治療前(4.08 ± 1.12 μM)和治療后SPF小鼠血清中肌苷的濃度(11.65±2.09μM),抗生素處理的SPF小鼠血清中肌苷的濃度(2.03±0.86μM;圖S11G)。這些數據表明,細菌在上消化道產生肌苷很可能是B. pseudolongum單菌定植小鼠全身肌苷水平升高的主要來源。



  肌苷的鑒定最初令人驚訝,因為肌苷與腺苷2A受體(A2AR)結合,已證明肌苷對體外Th1分化和體內抗腫瘤免疫有抑制作用,事實上,支持腺苷和A2AR結合后的免疫抑制作用的數據已經導致了新的免疫檢查點抑制劑靶點的開發,例如靶向CD73、CD39和CD38的單克隆抗體,以及A2AR的藥理拮抗劑,其中許多藥物目前正在臨床試驗中。然而,一小部分文獻已經證明肌苷類似物可以促炎,而A2AR信號可以維持小鼠的Th1/抗腫瘤免疫?;谶@些相反的發現,我們研究肌苷是否可以促進Th1細胞的體外分化。將活化的OVA 323-339肽脈沖骨髓源性樹突狀細胞(BMDCs)與原始OVA 323-339特異性OT-II CD4+T細胞共培養。有趣的是,肌苷在誘導或抑制CD4+Th1細胞分化方面的作用被證明是有條件的:具體地說,在外源性IFN-γ存在下,肌苷強烈地促進了T細胞的Th1分化(圖3A),而在沒有IFN-γ的情況下,肌苷抑制Th1分化(圖3B和圖S12A)。

  接下來我們解析了肌苷促進Th1分化的分子機制。盡管A2AR信號的藥理抑制完全消除了肌苷的作用,但是細胞滲透性環腺苷酸(db-cAMP,一種A2AR下游的信號分子),它的加入恢復了Th1的分化,并避開了對肌苷的需要(圖3A)。此外,抑制db-cAMP下游效應分子蛋白激酶A(PKA)可抑制肌苷驅動的Th1分化(圖3A)。此外,肌苷-A2AR-cAMP-PKA信號級聯導致轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白CREB的磷酸化(圖S12B),這是已知的Th1關鍵分化因子的轉錄促進劑,如IL-12受體和IFN-γ,事實上,我們還觀察到肌苷依賴的IL12Rβ2上調(圖S12C)。



  肌苷的作用是T細胞固有的,因為即使在沒有IFN-γ的情況下,向已被anti-CD3/anti-CD28-coated beads激活的單純T細胞中添加肌苷也能增強Th1分化(圖S12D) )(圖S12D)。此外,當肌苷刺激A2AR缺陷型T細胞時,沒有誘導Th1分化和CREB磷酸化(圖S12,E和F),相反,通過使用db-cAMP避開了對A2AR信號的需要,促進了A2AR缺陷型T細胞中Th1分化和CREB磷酸化,證實肌苷對Th1的促進作用依賴于A2AR信號(圖S12、E和F)。此外,由于已知pCREB可以與Th1關鍵靶基因結合,我們還證實肌苷刺激導致CD4+T細胞中Il12rb2和Ifng基因表達持續上調(圖S12、G和H)。重要的是,肌苷劑量反應實驗顯示,在B. pseudolongum單菌定植小鼠而不是Colidextribacter單菌定植小鼠血清中觀察到的肌苷生理濃度足以誘導Th1活化(圖S12I)。為了證實肌苷介導的Th1體外促進作用是否也適用于體內條件,用卵清蛋白聯合CpG作為共刺激物免疫GF小鼠。值得注意的是,我們利用CpG作為一種共刺激物,因為它是一種廣泛使用的抗腫瘤佐劑。一天后,小鼠腹腔注射肌苷或載體,肌苷增加了MLN中T-bet+IFN-γ+CD8+和T-bet+IFN-γ+CD4+T細胞的比例(圖S12,L到N),驗證了我們的體外實驗結果。

  接下來,我們確定B. pseudolongum對ICB治療療效的增強能力是否需要在T細胞上特異地表達A2AR,在攜帶MC38腫瘤的B.pseudolongum單菌定植的Rag1缺陷小鼠中評估抗腫瘤免疫,該小鼠已通過A2AR缺失或野生型T細胞轉移并用CTLA-4抗體治療(圖3C)。我們發現T細胞上A2AR表達的缺乏降低了B.pseudolongum對ICB治療療效的促進作用(圖3,D和E)。

  然后,我們確定了肌苷是否可以在不存在B.pseudolongum的情況下促進CTLA-4誘導的抗腫瘤免疫力,用MC38腫瘤細胞激發GF小鼠,在可觸及的腫瘤上,口服或全身給予肌苷或PBS,并聯合CTLA-4治療和CpG作為共同刺激物(圖3F)。與PBS相比,口服和全身給藥肌苷與CTLA-4和CpG一起給藥可降低腫瘤重量并提高抗腫瘤免疫能力(圖3、G和H)。相反,在沒有CpG的情況下,肌苷增加了腫瘤重量,降低了抗腫瘤免疫能力(圖3,G和H),驗證了我們先前的體外研究結果,即肌苷的作用是有條件的,并且取決于是否存在其它物質的共刺激。肌苷誘導的抗腫瘤免疫也依賴于T細胞中的A2AR信號,因為口服肌苷不能誘導轉移了A2AR缺失T細胞的MC38腫瘤無菌Rag1缺陷老鼠的抗腫瘤免疫(圖3,I到K)。這些數據表明,B.pseudolongum對ICB治療療效的促進作用是由肌苷介導的,并且依賴于T細胞中特異的A2AR信號。



  由于我們在ICB治療的腫瘤中檢測到A.muciniphila(圖1G),并且先前證明其可以提高ICB治療效果并在體外產生肌苷(圖S11C),因此我們進一步研究了A.muciniphila是否也依賴于A2AR信號來增強ICB治療效果。我們發現,A. muciniphila單菌定植結合CTLA-4抗體治療可導致更小的腫瘤并提高抗腫瘤免疫能力,這取決于A2AR的T細胞表達(圖S13,A到D)。

  盡管L. johnsonii的單菌定植能夠促進合CTLA-4抗體治療(圖1、I至K和圖S5)的抗腫瘤作用,但次黃嘌呤(A2AR的另一配體)在體外培養中升高,而不是肌苷(圖S11,C和D)。盡管如此,L. johnsonii的ICB促進作用雖然不如B. pseudolongum和A. muciniphila強,但也部分依賴于A2AR的T細胞表達(圖S13,E至H)。

  接下來,我們測試肌苷在細菌復合物存在的情況下是否也能促進CTLA-4抗體治療的療效。我們首先利用了gnotobiotic模型,在該模型中,小鼠被一個由12種細菌組成的微生物群(Oligo-MM 12)穩定地定殖,該微生物群缺少B. pseudolongum。結果在Gnotobitic Oligo-MM 12小鼠中發現肌苷能夠促進CTLA-4的抗腫瘤作用,腫瘤大小減小,腫瘤內IFN-γ+CD8+和IFN-γ+CD4+T細胞增加(圖S14,A到D)。我們還發現肌苷可促進SPF小鼠CTLA-4治療的效力,SPF小鼠含有高度多樣的微生物群(圖S14,E至H)。然后我們檢查B. pseudolongum增強抗CTLA-4的效力是否需要其有活性。盡管灌胃活的B. pseudolongum,無論是否經過抗生素預處理,都增強了SPF小鼠的CTLA-4的效力(圖S14,E至H),但熱滅活的B. pseudolongum無法增強ICB治療的效果,可能是由于無法產生肌苷(圖S14,E至H)。

  肌苷除了直接刺激T細胞外,還可能通過改變腫瘤細胞存活率或T細胞介導殺傷的易感性潛在影響腫瘤細胞。然而,MC38腫瘤細胞在體外直接暴露于肌苷并不能調節腫瘤細胞的存活率(圖S15A),并且在與活化的腫瘤特異性T細胞共培養之前對MC38腫瘤細胞進行預處理并沒有促進或抑制T細胞介導的腫瘤細胞殺傷(圖S15B),進一步支持肌苷抗腫瘤作用主要通過T細胞介導的結論。

  綜合起來,這些數據表明肌苷對T細胞的作用需要足夠的共刺激,IL-12受體參與Th1分化和IFN-γ產生以獲得有效的抗腫瘤免疫。事實上,與巨噬細胞相比,傳統的樹突狀細胞(cDCs)被發現是IL-12的主要來源(圖S16,A和B)。為了進一步評估樹突狀細胞(cDCs)在ICB-細菌聯合治療中的作用,將來自cDC-DTR小鼠的骨髓(BM)細胞轉移到致死性γ射線照射的受體SPF小鼠中,以允許cDC的誘導性條件耗竭。在骨髓(BM)重建后,用抗生素治療小鼠,并灌胃三種先前確定的促進ICB的細菌的混合物,即B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella,10周后,將MC38細胞植入小鼠體內,當發現腫瘤時,通過注射白喉毒素和CTLA-4抗體治療消除樹突狀細胞(cDCs)(圖S16C)。cDCs的耗竭導致更大的腫瘤(圖S16D),腫瘤內CD8+和CD4+T細胞頻率和IFN-γ產生顯著降低(圖S16E),顯著降低IFN-γ的產生和脾CD8+和CD4+T細胞的增殖(圖S16F)。因此,cDCs的耗盡大大降低了細菌誘導的ICB反應而已建立的抗腫瘤效果,提示cDCs需要持續的抗原遞呈、IL-12的產生和T細胞的共刺激才能有效地進行ICB治療,而cDCs和IL-12在PD-1抗體治療中的關鍵作用已被報道。

  由于增強Th1免疫通常被認為對大多數抗腫瘤反應是有益的,我們接下來確定在其它腫瘤模型中,用分離的促進ICB療效的細菌進行腸道定植或用肌苷治療是否同樣有效。首先,我們在SPF Msh2 LoxP / LoxP Villin-Cre動物中測試了B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella的ICB療效促進作用,這些動物在腸上皮細胞中有條件地使Msh2(DNA錯配修復基因)失活,并在小腸中發展出腺癌,結果發現在Msh2 LoxP / LoxP Villin-Cre模型中,單獨CTLA-4抗體治療(不添加ICB促進細菌)導致腫瘤重量、腫瘤中EpCam+Lgr5+細胞和上皮細胞干細胞標記物下降,腫瘤中T細胞活化和免疫細胞浸潤增加(圖S17,A至F)。與對照菌相比,同時添加ICB促進細菌顯著增強了CTLA-4抗體治療的作用(圖S17G),導致腫瘤重量和EpCam+Lgr5+細胞進一步減少,腫瘤中的T細胞活化和免疫細胞浸潤顯著增強(圖S17,H至L)。這些結果提示細菌聯合治療可以優化錯配修復缺陷(MMRD)腫瘤的治療方案。由于奧沙利鉑/PD-L1抗體聯合治療是臨床上更常用的治療方法,我們還證實了ICB促進細菌增強了SPF Msh2 LoxP / LoxP Villin-Cre動物奧沙利鉑/PD-L1抗體聯合治療的療效(圖S18)。由于B. pseudolongum在ICB治療動物的AOM/DSS腫瘤中富集(圖1,F和G),而且B. pseudolongum先前與改善ICB治療癌癥患者的療效有關,我們想知道是否在ICB治療的SPF Msh2 LoxP / LoxP Villin-Cre動物腫瘤中也富集了B. pseudolongum。結果發現雖然在CTLA-4或PD-L1抗體治療(圖S19A)后,腫瘤相關細菌總數沒有變化,但ICB治療導致腫瘤相關Bifidobacteria雙歧桿菌的特異性富集(圖S19B)。

  接下來,我們在SPF Apc2lox14/+;KrasLSL-G12D/+;Fabpl-Cre小鼠中檢測B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella的ICB療效促進作用,這些小鼠結腸細胞中具有條件性Apc缺乏和特異性激活Kras。在這個大腸癌模型中,與同型治療的動物相比,CTLA-4治療并沒有提高存活率(圖S20,A和B),并且ICB促進細菌的轉移也未能提高存活率(圖S20,C和D),這顯示了細菌聯合治療在該模型中的局限性。

  最后,我們測試細菌代謝物肌苷聯合共刺激是否足以提高ICB治療其它癌癥模型的療效。在SPF Msh2 LoxP / LoxP Villin-Cre小鼠中口服肌苷與CTLA-4和CpG治療可顯著降低腫瘤重量,并相應增加脾臟IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8+T細胞(圖4,A至F)。

  重要的是,還發現肌苷與CpG一起可有效提高抗CTLA-4在另外兩種癌(膀胱癌和黑素瘤)中的功效。具體來說,向注射了MB49鼠膀胱癌細胞的GF小鼠同時施加肌苷和CpG能夠顯著增強CTLA-4減輕腫瘤重量的能力,并增加了浸潤腫瘤的IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8+T細胞的比例(圖4,G至K)。同樣,肌苷加CpG增強了黑色素瘤異位小鼠模型中CTLA-4介導抗腫瘤免疫的能力(圖4,L至P)。



  綜上所述,我們的結果確定了從ICB治療的結直腸癌腫瘤中分離出的B. pseudolongum(假長雙歧桿菌)是一種關鍵的共生腸道細菌物種,它能夠促進cDC(樹突狀細胞)依賴的Th1細胞回路,從而大大增強ICB療法在小鼠腸道和上皮性腫瘤模型中的效果(圖S21)。這些數據支持這樣一個前提,即用特定的微生物聯合體對微生物群進行調整,可能為結直腸癌和其他癌癥的ICB治療提供一種有前途的輔助療法。雖然從老鼠身上分離出來,但這三種促進ICB療效的細菌也在人類身上發現,這表明它們有轉化的潛力。此外,我們分析了已發表的人類糞便微生物組宏基因組數據,發現了一個趨勢,盡管并不顯著,但與無反應的癌癥患者相比,ICB治療應答者中B. pseudolongum的富集量高達2.4倍(圖S22A)。在屬水平上,與無應答者相比,ICB治療應答者中Bifidobacteria雙歧桿菌富集量高達5.9倍(盡管不顯著)(圖S22B),其中,B. longum和B. adolescentis明顯富集。由于在成人糞便樣本中B. pseudolongum的豐度較低,因此采用更大樣本量來證實這一趨勢。我們還確定肌苷是一種關鍵的細菌源性代謝物,通過T細胞特異性A2AR信號以一種上下文依賴的方式(例如同時需要CTLA-4抗體和CpG的共刺激)促進Th1細胞的激活。我們進一步證實,已知對ICB治療有響應的A. muciniphila是利用肌苷-A2AR受體信號來傳導其對ICB治療的促進作用。根據我們的研究結果,可能會警告癌癥免疫治療不要阻斷肌苷-A2AR受體信號傳導,因為這可能會抵消有益微生物提供的任何積極作用。我們建議A2AR受體信號傳導可能是細菌-ICB聯合療法不可或缺的抗腫瘤途徑,有必要進一步研究黃嘌呤和次黃嘌呤(肌苷的降解產物)的作用。





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