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【昊文章】天昊WES平臺助力客戶解析遺傳性小兒肝病與基因雙等位基因突變的“復雜情緣(2)

發稿時間:2020-10-14來源:天昊生物



近日,王建設教授課題組發表最新文章,又一次揭示了致病基因雙等位基因突變導致一種新的遺傳性肝病,這一成果于731日在線刊登于BMJ旗下的全球知名遺傳病雜志Journal of Medical Genetics。


英文題目:Biallelic loss-of-function ZFYVE19 mutations are associated with congenital hepatic fibrosis, sclerosing cholangiopathy and high-GGT cholestasis

中文題目:ZFYVE19基因雙等位功能缺失突變導致臨床表型為先天性肝纖維化、硬化性膽管炎和高GGT膽汁淤積癥的新遺傳性肝病

發表期刊:Journal of Medical Genetics

影響因子:4.943


先天性肝纖維化(CHF)為一種罕見的先天發育異常,其主要后遺癥是門靜脈高壓癥(PH),臨床上常表現為脾腫大、脾功能亢進和靜脈曲張出血。CHF反映了纖毛原發性的功能障礙,并常伴有其他器官畸形或其他系統的故障。大多數存在DPM/CHF的纖毛疾病只有在并發感染或膽道梗阻時才會表現出膽汁淤積癥。

肝內膽汁淤積癥可以分為2類:一類是血清中γ-谷氨酰轉移酶(GGT)的活性與血清共軛膽紅素都上升;另一類是在正常范圍內,但存在高膽紅素血癥。

對于許多臨床表型為肝內膽汁淤積癥和高GGT活性的兒童患者,其肝膽病的遺傳病因仍未確定。本研究的目標是為了發現患有特發性高GGT肝內膽汁淤積癥兒童的疾病相關突變基因。



樣本收集:患者:2004-2017年,納入兒童患者25例,均表現原因不明的肝內膽汁淤積癥和高GGT。對照樣本:其它肝病患者對照(45例,GGT正常的膽汁淤積患者或者無膽汁淤積的其它肝病患者);無肝臟疾病的對照樣本(299例)。

實驗方法:WES測序;mRNA和蛋白序列分析;免疫組化檢測;表達載體構建;基因敲降;從患者誘導的多能細胞中提取成纖維細胞樣細胞;免疫熒光顯微鏡分析;免疫蛋白印跡



● ZFYVE19中的雙等位基因突變與高GGT肝內膽汁淤積癥有關

基于25例患者的WES或目的區域測序數據,有9例患者都存在ZFYVE19純合或復合雜合突變(圖1AB;P1患者因DNA不足,采取ZFYVE19目的區域測序,其它患者為WES測序樣本),家系樣本驗證確定突變的遺傳模式是常染色體隱性,且患者均沒有ABCB4突變。其它兩個對照人群均沒有ZFYVE19的雙等位基因突變。  


● ZFYVE19基因的備用翻譯起始位點

ZFYVE19基因富含鳥嘌呤的區域發現了G-四聯體(圖2A)。數據庫注釋的翻譯起始位點AUG很可能被G-四聯體的存在所抑制(G-四聯體是穩定的翻譯抑制性二級結構,大多位于5′非翻譯區域)。c.112_113insGGGGC(rs142730574)為一個無功能多態,在ExAC中記錄的頻率很高,雜合子為35.55%,同源子為12.6%。當GGGGC存在時,下游具有Kozak序列的AUG(dAUG)可能是一個替代性的翻譯啟動點,可以從76位蛋氨酸(M76)開始翻譯出一個396個氨基酸的的異構體。M76在不同物種中具有高保守性(圖2B)?;隗w外過表達實驗,證明當c.112_113insGGGGC存在時,破壞了471個氨基酸長度的ZFYVE19蛋白生成,只能生成396個氨基酸的異構體。針對這個異構體,重新注釋之前在患者中測到的突變,5個突變均完全破壞這個異構體的功能。



 ZFYVE19敲降產生的表型導致纖毛和中心粒異常

患者肝組織的組織病理學和免疫組織化學研究結果均提示存在纖毛病理,作者評估了hRPE1和成纖維細胞中ZFYVE19敲降后的纖毛相關表型。在ZFYVE19基因敲降的hRPE1細胞中,一個突出的表型異常是基底體/中心粒的數量增加。同時也觀察到中心粒對的分離/不正常排列(圖5A)。纖毛的組裝沒有受到影響(5C),額外的纖毛在額外的基體/中心粒處形成(圖5A)。源自患者iPSCs(圖5D-F)的ZFYVE19缺失成纖維細胞樣細胞中,也觀察到類似表型異常。因此,研究者的數據表明ZFYVE19參與了纖毛相關過程。


鑒定出ZFYVE19基因存在下游翻譯起始密碼子,促使研究者證明ZFYVE19存在起始于M76的功能異構體。在ZFYVE19患者中發現的五個突變都位于介導ZFYVE19和囊泡蛋白分選相關蛋白4VPS4)相互作用的FYVE型鋅指域或MIM1-A基團。五個突變被預測存在致病性,很可能會導致翻譯啟動被破壞或者RNA的無意降解,導致ZFYVE19完全喪失功能。事實上,在攜帶純合無義突變的患者(P14P29)中,研究者的確沒有檢測到ZFYVE19在肝臟中的表達(圖1C)。

纖毛功能障礙引起的發育和退行性疾病,被稱為纖毛疾病,影響到各個器官和系統,并表現出不同的臨床特征。在肝臟中,肝細胞不表達纖毛,但膽管細胞表達。它們的初級纖毛延伸到膽管腔內。膽汁的變化流動和組成被認為是通過纖毛感知并轉化為功能的變化。編碼纖毛相關蛋白的基因突變可能會導致門靜脈的發育不全,橈骨,門靜脈纖維化增加和增生。這一系列異常被稱為管板畸形(DPM)或CHF。本研究的ZFYVE19突變患者在組織病理上的表現與DPMCHF一致,同時伴有硬化性膽管病。我們認為他們的疾病是一種新的纖毛病,并將其歸因于ZFYVE19的突變。

然而,本文探討的遺傳性肝病有一個臨床表型并不常見于纖毛病。表現為DPMCHF的纖毛病一般與GGT值的升高和膽汁淤積癥(除非膽道梗阻或感染)無關。此外,本文的患者有硬化性膽管病與膽汁淤積的組織病理特征。這些變化表明膽道損傷是ZFYVE19肝病的重要表現。

另外值得關注的是,本文的患者臨床上缺乏肝外表現。纖毛疾病,理論上是一種多器官和多系統的疾病。研究者預計,隨著對其他ZFYVE19突變患者的研究,疾病表型將擴展到肝膽道以外的器官和系統。此外,研究者還將對ZFYVE19疾病患者進行長期跟蹤??纯措S著他們的成長,ZFYVE19缺失是否會產生新的影響。鑒于體外實驗發現ZFYVE19敲降后發生異常的染色體分離和DNA損傷,研究者將考慮惡性腫瘤風險增加的可能性。




(來源于復旦感染兒科公眾號):

探索真理的道路從來不是一帆風順,創新性越強,研究難度越大,耗時越長。從初次通過二代測序方法從病人中篩選出ZFYVE19,到研究成果被認可并發表,歷時漫長的6年時間,經歷了多位研究團隊成員的接力奉獻。由于既往對于這一基因功能的研究十分有限,初期在國際學術會議進行報道時受到了業內學者的較多質疑。為了尋找致病證據,課題組研究人員積極收集更多病例、隨訪病人,提供具有說服力的家系證據;與華山醫院、仁濟醫院合作,收集病人肝移植術中的組織樣本進行研究,證明在病人中該蛋白表達缺失;與奧地利格拉茨大學醫學院病理系合作,分析研究病人肝組織的病理特征,從病理特征推測此病應該是纖毛病,終于找到進一步深入研究的線索;與中科院深圳先進技術研究院合作,通過細胞系模型和病人來源的誘導干細胞實驗證實ZFYVE19變異影響纖毛形成,首次明確該基因與纖毛形成的直接相關性;與復旦大學生物醫學研究院合作,發現ZFYVE19基因的數據庫注釋存在缺陷,從而導致這一基因在測序分析中容易被忽略,作者通過該基因轉錄和蛋白翻譯方面進行深入研究,對該基因的翻譯起始位點進行了新的注釋,故而至今才被學術界揭示,克服了注釋錯誤對研究造成了多重壁壘。在多方協助、共同努力下,課題組克服重重困難,歷時多年的研究成果終得以獲得業內專家認可,也代表復旦大學附屬兒科醫院肝病科的專業研究水平登上了一個新的高峰。



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